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[牙体牙髓] 外伤牙牙髓再生治疗失败病例的回顾性免疫组织学分析

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发表于 2019-10-28 09:44:03 | 显示全部楼层 |阅读模式
        —— Regenerative Endodontic Procedures Posttrauma: Immunohistologic Analysis of a Retrospective Series of Failed Cases. J Endod. 2019;45(4):427-434
       活髓治疗中,生物材料的应用促进了保守和微创治疗方法的发展。然而,对感染的未成熟恒牙的保守治疗仍然是一个挑战。牙髓再生治疗(REP)旨在通过刺激或将干细胞移植到根管中来恢复坏死牙髓的功能。尽管临床和影像学检查在根尖周骨愈合和解决临床症状方面均显示出良好的结果,但免疫组织学研究报告显示是牙髓-牙本质复合物修复而不是再生。通常,根管壁的增厚和加长似乎进展缓慢,并且修复组织和钙化组织的并置是否会增强这些脆弱的牙齿尚不清楚。然而,牙外伤对儿童的影响最大,在牙列增长的情况下可能需要正畸治疗。由于只有少数临床试验报告了REP牙齿的长期存活,因此以下问题仍未得到解答:
1.这些牙齿是否足够坚固以承受正畸负荷吗?
2.正畸治疗过程中,有没有可能出现根尖周炎?
3.在骨骼完全生长之前,这些牙齿会保持功能吗?
       缺乏证据使得难以做出多学科决策。但是,研究治疗失败的病例也可能有助于发展牙髓再生治疗。因此,本研究旨在研究3颗牙髓再生治疗失败拔牙后的免疫组织学结果。
组织加工和免疫组织学过程
       拔牙后,用6%甲醛固定牙齿。病例一的牙齿随后由一名作者使用NRecon(版本1.6.9.8;Bruker microCT)扫描,使用软件Phoenix NanoTom S(7毫米像素尺寸,0.5毫米铜滤波器,80 kV和320mA)进行重建,并使用Dataviewer进行分析(图1Ag和1Ah)。纳米计算机断层扫描用于无损地观察牙齿根部的三维形态,并观察是否存在修复性矿化组织的形成。按照Meschi等人的描述,对牙齿进行制备、加工和免疫组织化学染色,唯一的例外是,在脱矿之前,分离牙齿的冠部,以便减少脱矿时间。经masson三色染色(TCM)后,选择神经丝(NF)、泛细胞角蛋白(PK)、牙本质唾液磷酸蛋白(DSPP)和革兰氏(G)阳性/阴性作为免疫组织学标记。然后在光学显微镜下检查染色切片并扫描。
临床病例
病例一:
患者,女,6岁,骑自行车时摔伤导致前牙外伤。她就诊时带来一个全脱出的,未成熟的右上颌恒中切牙,该切牙保持干燥1.5小时,然后不久储存在牛奶中。牙科医生根据要求用生理盐水清洗牙齿,将其重新植入牙槽窝中,并利用弹性夹板进行固定。根据国际牙科创伤协会(IADT)的指导原则(具体原则可参考本公众号2018年1月8、9号上传的外伤牙治疗指南,对于具有开放根尖孔且口外干燥时间大于60分钟的牙齿,可以再植之前或之后进行根管治疗。但是,IADT指南也确实指出,除非有临床或影像学证据显示牙髓坏死,否则应避免对未成熟的再植牙进行根管治疗。术后为病人开了阿莫西林,布洛芬和洗必泰漱口水,建议患者患牙勿啃咬硬物并固定至少2周。创伤后4周,拆除牙弓夹板时发现患者右上颌中切牙上出现了急性根尖脓肿。牙齿叩诊,电活力测试或冷诊检测均没有反应,并且前庭处牙龈肿胀。拆除夹板,并由另一位牙髓医生进行REP,该操作根据欧洲牙科学协会(ESE)的声明进行牙髓再生治疗(关于欧洲牙科学协会(ESE)具体原则本公众号后续会推出相关的文章)。用含血管收缩剂的麻药进行局部麻醉后,橡皮障隔离患牙,开髓,显微镜下可以看到牙髓,并在距切缘15 mm处用锉探诊检测感觉。用次氯酸钠(1.5%,20 mL)和生理盐水(20mL)在牙髓上方2毫米处进行根管冲洗消毒。用无菌纸尖吸干根管,然后将氢氧化钙糊剂放置在牙髓上方2 mm,封药14天,以防止与感染相关的侵袭性强吸收。上方放置消毒棉球后,用玻璃离子水门汀(GIC)暂封牙齿。复诊时,使用无血管收缩剂的麻药进行局部麻醉。与初诊时一样,整个复诊过程中都是在橡皮障隔离和显微镜放大下进行的。在牙髓上方2 mm处用EDTA(17%,30 mL)冲洗根管后,采用35号锉根尖针刺出血。随后,随后,Collaplug被用作阻射性纯硅酸盐水门汀(MPC)(一种类似于MTA的材料)的支架,用玻璃离子和纳米树脂材料(图1Ac)充填牙齿。然而,在治疗后3个月,REP的牙齿已经发生牙固连,并明显处于牙合平面下方约1.5mm(图1Ad和Ae)。对于之前所述的所有敏感性测试,牙齿仍为阴性,并且患者出现了安氏II级错牙合畸形。在儿童牙病科,正畸科和牙髓科的多学科讨论后,决定拔除两个上颌中切牙,以促进上颌侧切牙和尖牙的对称性萌出和自发性近中移动。与患者及其父母沟通后,知情同意后,在REP后5.5个月拔除牙齿(图1Af和1Ai)并进行组织分析。正畸医生对患者的正颌发育进行了进一步随访(图1Aj)。
       上颌左右中切牙拔牙后五个月,上颌侧切牙均自发萌出和近中向移动(图1Aj)。从冠部到根尖,对拔除患牙进行免疫组织学染色(图1Ba)和纳米计算机断层扫描(图1Ag)显示在硅酸盐水门汀(MPC)下方的钙化桥(图1Ba和Bn),带有血管和矿化核的结缔修复组织(图1Ba和Bm),并且有矿化修复组织紧靠内吸收的根管壁(图1Bl和Bm)。健全的牙齿呈现出血管化的牙髓组织(图1Bb和Bd),而在DSPP+牙髓-牙本质表面上没有吸收(图1Be)。牙本质,前牙本质,成牙本质细胞以及牙髓中DSPP的表达在正常牙齿中比在REP牙齿中的表达更为明显(图1B1)。两颗牙齿的牙周膜中残留的malassez上皮细胞为PK+(图1Bg和Bj)。REP牙齿的修复性组织中的神经纤维(图1Bk)比健康牙齿牙髓中的神经纤维(棕色)少(图1Bf)。REP牙齿中还可见神经血管束(图1Bi)。REP牙齿和健康牙齿中均为革兰阴性。然而,牙本质小管中的凋亡中性粒细胞(图1Bh)和炎性液体(图1Bc)显示存在持续的炎症。

病例一:一名6岁女孩右上颌中切牙撕脱。
(A)临床照和x线片:
(a)外伤后口外照;(b)右上颌中切牙复位和夹板后;(c)REP复诊结束时;(d和e)REP后3个月;(f)拔除的右上颌中切牙(g)提取的右上颌中切牙的计算机断层扫描,显示从根冠到根的根管外壁和根管内壁的吸收,GIC,硅酸钙水门汀(MPC),钙化桥(CB)和氢氧化钙(CH)残留物。(h和i)拔除的左上颌中切牙和计算机断层扫描;(j)左右上颌中切牙拔牙后5个月。
(B)免疫组织学:
(a)根管内的硅酸盐水门汀(MPC)和修复性组织;(b)健康的牙齿;(c)炎性液体(IF)渗入牙本质小管中的REP牙齿;(d和e)表示牙髓和牙本质壁;(f)健康的牙齿和牙髓(箭头指向被NF染成棕色的轴突);(g和j)箭头指向REP牙齿(g)和健康牙齿(j)牙周膜中残余的Malassez上皮;(h)REP牙齿显示在修复组织的中性粒细胞凋亡;(i)REP齿(箭头显示神经血管束); (k)REP牙齿(箭头指向修复组织中的NF+染色);(l)显示修复性矿化组织(MT)贴壁的修复牙(箭头指向内根管壁吸收);(m)REP齿显示MT并置于根管壁(黑色箭头指向修复组织中的矿化核,白色箭头指向修复性组织中的血管);(n)REP牙齿显示硅酸钙水门汀(MPC)在根管的冠方。

病例二
患者,女,9岁。右上颌恒切牙复杂冠折(图2Aa和Ab)。在全身麻醉和局部麻醉下,根管消毒,并由牙医应要求对冠部折裂片进行复位(记录中未提及治疗规范)。一个月后,该患者因脓肿和冠部折裂片脱离而来儿童牙科就诊。按照与病例一相同的步骤进行REP。但是,在第一次REP期间,冠部折裂片用复合树脂重新粘接(图2Ac–Af),治疗过程中使用3%的次氯酸钠(而不是1.5%)。利用氧化锌丁香酚水门汀暂封(代替GIC)。本病例中,在消毒过程中也能检测到部分活髓。
       在6个月复诊时,患者主诉是牙齿碰到时会有敏感,锥形束CT(CBCT)扫描显示根尖周围的持续病变(图2Ag)。患者上,下牙列前部出现安氏II类错牙合畸形并有拥挤。在正畸,牙髓和修复科之间进行了多学科讨论之后,在第一象限中拔除REP牙齿并进行近中牵引治疗(图2Ai–Ak)长期预后更好。知情同意后,在REP后7个月拔出牙齿(图2Ah)。
       图2B呈现了病例二中的masson三色染色,NF和革兰氏染色。对于病例二,PK和DSPP染色不够特异性。从冠部到根尖,可见以下(图2Ba和Bc):硅酸钙水门汀(MPC),MPC下方的钙化,伴有昼夜节律性(18),修复组织和根尖**肿。矿化的修复组织沉积在根管内壁上(图2Bb)。NF的表达只能在根尖**肿中发现(图2Bd)。尽管存在根尖**肿,样品仍为革兰氏阴性(图2Bf和Bg)。


病例二:一个9岁的女孩,右上颌恒切牙的复杂冠折。
(A)口内照和x线片:(a)复杂的冠折;(b)前庭脓肿;(c和d)REP;(e–g)REP后7个月出现持续性根尖周病变;(h)拔除后,根尖**肿;(i和j)上颌骨快速扩弓,并侧切牙近中牵引替代右上颌中切牙;(k)拔出REP牙齿后15个月拍摄的X线照片。
(B)免疫组织学:
(a)Masson三色染色(TCM):*根尖**肿,**修复性结缔组织,***由硅酸钙水门汀(MPC)引起的钙化(****);(b)Masson三色染色(TCM):*相对于根管内壁的修复性矿化组织并置;(c)Masson三色染色(TCM):放大后可见钙化组织成昼夜节律性;(d)根尖乳头中的NF +染色(棕色);(e)根尖**肿的一部分,含有淋巴细胞(箭头)和浆细胞(圆圈);(f和g)革兰氏阴性的牙本质小管。

病例三
患者,女,8岁,左右上颌恒中切牙简单冠折(没有牙髓暴露)(图3Aa)。急诊时,儿童牙病科通过间接盖髓术,即用氢氧化钙盖髓和GIC充填。复诊时,用复合树脂修复患牙(图3Ab),检查发现冷诊阳性。然而,创伤后8个月,左中上颌恒切牙检查冷诊阴性,并出现前庭脓肿。采用与病例二相同的治疗方法。本病例中即使探测到活髓,形成血凝块的过程也是痛苦且漫长的。不使用CollaPlug支架,将磷酸锌水门汀(代替GIC)放置在复合树脂的下方(图3Ac)。在复诊中,患牙无不适,叩诊,冷诊或电活力测试无反应。在REP后20个月的复诊和随访中(图3Ad),根尖周病变愈合,并出现了根尖形成。但是,由于硅酸盐被推得离根尖太远,因此根管壁没有太多增厚(图3Ae–Ag)。在正畸,牙髓和修复科之间进行了多学科讨论之后,决定拔除该牙齿,而不是拔除一个健康的前磨牙来创造空间。上颌和下颌前部牙列牙齿拥挤以及安氏I类错牙合畸形。REP后的22个月,拔除了牙齿。七个月后,右上中切牙也被拔除以对称,随后,侧切牙向中线处牵引(图3Ai和Aj)。在接下来的阶段中,将使用复合树脂对这些牙齿进行美学改造。
       图3B代表了病例三的Masson三色染色,NF和革兰氏染色的组合。案例3的PK和DSPP染色不够特异性。从冠部到根尖,可见以下内容(图3Ba):硅酸盐水门汀(MPC),由于硅酸盐水门汀(MPC)中的磷酸盐而形成钙化前沿,骨样组织(牙周组织向内生长)和根尖乳头。牙周膜(图3Bb)和根尖乳头(图3Bc)为NF +。整个样品为革兰氏阴性(图3Bd和Be)。
病例三:一个8岁女孩,其左右上颌恒切牙的简单冠折。
(A)临床和影像学检查:
(a)外伤后即刻x线片,(b)外伤后6个月,(c)外伤后8个月,左前中切牙因前庭脓肿而接受REP,(d)REP后20个月,(e–g)REP后22个月,在(f和g)CBCT扫描中可见持续性根尖周病变,(h)拔牙后,将牙齿切成Fig3 Ag中黄线标记的水平,(i和j)左侧上颌中切牙拔牙后1年进行上侧切牙近中牵引。
(B)免疫组织学:
(a)Masson三色染色(TCM):*硅酸盐水门汀(MPC),**由于硅酸盐水门汀(MPC)中的磷酸盐所致的钙化前沿,***骨样组织(牙周组织向内生长),以及****根尖乳头;(b和c)箭头:(b)牙周膜和(c)根尖乳头中的NF +;(d和e)革兰阴性的根尖乳头(d)和牙本质小管(e)。
讨论:
       为了维持感染的未成熟恒牙牙根的发育,美国牙髓病学会(AAE)和欧洲牙髓病学会(ESE)提出牙髓再生治疗作为治疗选择。即使缺乏长期证据,临床医生也希望保留这些牙齿,从而保护牙槽骨,至少至骨骼生长完成。尽管如此,还是有失败,牙齿早于预期发生缺失。本病例系列描述了3例牙髓再生治疗失败病例的组织学结果。
       病例一中描述的牙齿脱落是由外伤后遗症引起的,如今仍无法通过现有的治疗方法来规避。遵循IADT准则。延迟脱落的牙齿再植后,牙固连几乎是不可避免的,必须予以考虑。如果根尖孔开放,除非有临床或影像学证据表明牙髓坏死,否则必须避免根管治疗。然而,牙再植后4周,发生了急性脓肿。由于极不成熟的受感染恒牙在牙髓治疗后容易发生颈部根折,因此建议使用REP,而不是根尖诱导。由于牙固连的发生不可避免,因此在以后的阶段中,如果恢复牙髓活力而不是根管充填,则冠部修复变得容易很多。尽管如此,在目前的情况下,牙固连发生得比预期更快,冠修复不再是一种这种牙的治疗选择。拔出上颌中切牙后,侧切牙加速萌出和近中向移位(图1Aj)。在适当的时候,上颌侧切牙和尖牙牙冠调磨和修改,分别成为中切牙和侧切牙。
       关于病例一的免疫组织学结果,在REP牙齿中可检测到带有血管和神经组织的修复性组织(图1Ba和Bm)。有证据表明,与健康牙齿相比,这类牙髓再生的牙齿在修复过程中,矿化组织并置在内根管壁,矿化核,成纤维细胞和神经组织较少(图1Bk-Bm)。然而,该修复性组织是否在REP之后(重新)产生,或者是否仅/部分是原始牙髓的疤痕组织残留,尚不确定。这种带有钙化的修复性组织是否能够增强牙齿,目前还不清楚。硅酸钙水门汀在REP牙齿中硅酸钙水门汀下方的钙化桥由硅酸钙水门汀诱导,因为它具有诱导成牙骨质和成骨潜能。使用硅酸钙水门汀代替MTA以避免变色。修复性组织中的不透明(钙化)颗粒(图1Ba和Bm)很可能是氢氧化钙的残余物(图1Ag),当严格执行欧洲牙髓学会的处理原则时,氢氧化钙的残余物不会被冲走。
       然而,病例二和病例三中的拔牙是由于REP结果不理想所致。尽管在REP期间进行了消毒,但轻度(病例三)至严重(病例二)的根尖周炎仍然持续。欧洲牙髓学会ESE关于牙髓再生治疗的声明中规定,次氯酸钠的浓度应在1.5%至3%之间,要依靠足够的消毒和干细胞保存之间的平衡但是,即使病例二、三中的次氯酸钠浓度是病例一的两倍,尽管病例二、三中的牙齿为革兰阴性,但炎症反应只能由细菌引起。这使为REP建立的消毒规程受到质疑。此外,由于创伤后牙髓坏死是进行REP的原因,即使病例一中的外伤更为严重,这2例患者的失败也可能是由于创伤后遗症引起的。先前已描述,与解剖学异常相比,当病因是牙外伤时,REP的结果降低/较差。

病例二(图2B)的免疫组织学图像的根管内部分与病例一非常相似,不同之处在于病例二的钙化桥大得多,并且具有特殊的外观:深浅暗影系统地重复,就像在硅酸钙水门汀诱导的硬组织中存在昼夜节律一样(图2B)。
关于病例三,重要的一点是,建议将光固化玻璃离子用作复合材料和水硬性硅酸钙水泥之间的中间层,而不是磷酸锌水门汀。在病例三中,MPC被无意地推走了太远,可能是因为血凝块不够坚硬,重要的是没有CollaPlug作为硅酸钙水门汀的支架。在临床上,诱导出血比病例一和二更加困难。因此,没有实现将间充质干细胞引入牙髓以再生牙髓,并且根管内出现明显钙化。这种钙化部分是由硅酸钙水门汀的冠部和部分牙周组织诱导的,恰好在钙化前沿(图3B)。尽管如此,对病例三的免疫组织学分析显示,根尖具有重要的根尖乳头,因此具有生长潜力。考虑到根尖周病变已愈合,至少实现了针对再生牙髓治疗的AAE临床考虑的主要目标。因此,案例三不会是“失败”的案例,而是REP结果不能令人满意的案例,因为就根管壁增厚和延长而言,没有进一步的根发育。但是,如其他REP研究所示,进一步获得至少30%的根发育需要1-3年。遇到以下问题时,这会给正畸决策加重负担:是否应该拔出健全的前磨牙只是为了保留弱的未成熟切牙,预后未知?另外,对(持续的)根尖周炎的放射学诊断至关重要。在第2和第3例中,很难在二维根尖X线片上分辨(图2Ae和3Ad)是否有根尖病变(图2Ag和3Ag)。如果可以将放射剂量保持在尽可能低的水平,则建议进行CBCT扫描。此CBCT扫描可用于多学科决策,即牙髓治疗,牙齿修复和正畸治疗计划。根据文献报告,Chaniotis的决定是基于根尖周x线片。在本研究中,拔除了2个上颌前磨牙,保留了一个假定愈合根尖周病变的永久性中切牙,并进行了正畸牵引移动。即使牙齿在没有临床症状的情况下承受了正畸力,如果没有任何精确的(三维)影像学检查,假设牙齿是根尖周愈合的,也是不可靠的。
       关于目前和以往的免疫组织学研究,可以得出结论,无论治疗是否成功,基于细胞归巢技术的REP都会导致修复而不是再生。在本研究中,由AAE和ESE建议的消毒方案不足以治愈根尖周病变和临床症状,这在组织学上已通过炎性细胞的存在得到了证实(图1Bh和2Be)。在未来的临床试验中,为了更充分地显示可能导致治疗失败的细菌的存在和种类,应考虑到用于定量聚合酶链反应分析的细菌取样。此外,与二维x线片相比,用于多学科应用的CBCT成像似乎是一种有价值的工具,可以更准确地诊断骨愈合并精确评估牙根的发育/吸收。由于儿童前牙的更换具有挑战性,因此建议在牙髓病医生,儿童牙病科医生,正畸科医生和修复科医生的密切多学科咨询中,对REP失败进行决策和治疗计划的制定。为了使这种以生物为基础的治疗在牙髓治疗中占有一席之地,有必要更好地理解和及时地预测REP中的生物相互作用。

李娜译  江苏牙体牙髓
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